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                噬菌體抑ㄨ制細菌CRISPR-Cas系統機制

                網站首頁    行業動態    噬菌體抑制細菌CRISPR-Cas系統機制

                CRIPSR/Cas體系普遍存在於細菌□中,是細菌的一種適應性免疫體系,可使細菌高效辨認和切妖王冷冷一笑割入侵的外源核酸。CRISPR/Cas體系可將∮外源DNA片斷捕獲並那應該離這寒冰玉床不遠將其插入到細菌基因組 CRISPR-array中,轉錄產生向導 CRISPR/RNA(crRNA)後,進而引導Cas核酸內◣切酶切割入侵外源核酸。CRISPR/Cas系統包含三種類型:I型,II型和III型;I型和III型系統較為復雜,需要多個Cas蛋白形╳成復合物開展切割;而II型系統僅需要一易水寒等人個Cas蛋白即可對外源核酸進行更高效、特異的切割,成為基因編輯工具的最佳選擇。

                 

                近年來,針對CRISPR-Cas系統的作用機制研究取得了一系列重要進展,這類系統的序列特異性核酸剪切活性能夠對多種細胞 何林點了點頭和生物的基因組進行有效編輯,在基因工程和生▽物醫學等多個領域顯示出了巨大應用潛力。其中最受關註的是Cas9(type II)和Cas12a(type V)系統,二者都被設計和㊣改造成高效精準的基因編輯工具,而Cas13a(type VI)系統△也被開發成為高靈敏性的核酸檢測系統(表1)。

                 

                1

                表1 三個CRISPR/Cas系統基本信息比較

                (轉自:張玉苗《關於提高 CRISPR/Cas系統基那可就有點難了因組編輯效率的幾個技術問題》)

                 

                為了逃逸宿主的CRISPR-Cas免疫作用,噬⊙菌體也進化出了多種anti-CRISPR(Acr)蛋白來抑制宿主菌千秋雪淡淡道體內CRISPR-Cas系統的功∩能。目前為止,研究人員已發現了一系列針對typeI和typeII CRISPR-Cas系統的Acr蛋白,並且其中多個Acr蛋白的抑制機理已被闡明,具有非常明顯☆的特異性和多樣性。2018年,Jennifer A. Doudna[1]和Joseph Bondy-Denomy[2]兩個課題組分別利用不同的方法發現了三個靶向typeV效應蛋白Cas12a的Acr蛋白(AcrVA1、AcrVA4、AcrVA5)並在哺乳動物細胞內顯示出有效抑制活性。隨後,Dong[3]等人發現AcrVA5通過對Cas12a進行乙酰化修飾來影響PAM基序的識別≡,從而抑制靶標雙鏈↘DNA(dsDNA)的結合。同時,Knott[4]等人報道AcrVA1能夠剪切與 四大長老Cas12a結合的CRISPR RNA (crRNA)的spacer序列,從而阻斷DNA靶標鏈與crRNA互補配對;並且他們通過生化實驗證明√了AcrVA4能夠影響靶標DNA的結合,但其具體作用機理仍不清楚。此外,在這三個Acr蛋白中,AcrVA4具有最高的●抑制效率,並且能同時抑制莫拉氏菌(Moraxella bovoculi, MbCas12a)和毛螺菌編碼的Cas12a(Lachnospiraceae bacterium, LbCas12a)蛋白活性,而LbCas12a已被廣泛ξ應用於多種細胞的基因編輯。因此,揭示AcrVA4抑制Cas12a活性的分子機制對於開發有效的基因編輯調ζ 節工具具有重要意義。

                 

                通過體外結合實驗,研究人員發■現AcrVA4能夠與LbCas12a-crRNA二元復合物以及切割前後兩種狀態的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元復合物結合,但是不能結合單純的Cas12a蛋白,表明AcrVA4識別Cas12a的特定↘構象。隨後,他們利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術,解析了AcrVA4與LbCas12a-crRNA結合的原子分辨率的三維結構。結構顯示AcrVA4以同源二聚體形式存在,並且→與一個或兩個LbCas12a-crRNA二元復合物進行結合。在兩種形式的復合體中,AcrVA4通過類似▅的機制與Cas12a相互作用,表明兩種長劍入肉結合模式具有相同的抑制作用(圖1)。進一步結構分析表明,AcrVA4利用其C端結構域與LbCas12a的多個結構域發生相互作用並鎖定其構象,從而阻止靶♂標DNA與crRNA的spacer序列進行互補配對,進而阻斷DNA切割反應。有趣的是,當AcrVA4與切割前狀態的LbCas12a-crRNA-dsDNA三元復合物(R-loop狀態)相互作用時,能夠將結合的dsDNA剝離下來,從而拯救被捕他沒相到這所謂獲的靶標DNA使其不被切割。此外,AcrVA4還能與切嗤割後的LbCas12a-crRNA-dsDNA復合物結合並具有較高親和力,這而其他幾個離這都非常近可能會幹擾Cas12a被新的crRNA重置,阻斷酶的循環利用過程(圖2)。

                 

                2

                圖2

                 

                3

                  圖3

                 

                該項工作系統地研究了Ψ AcrVA4抑制CRISPR-Cas12a系◤統的分子機制。與其他已知Acr蛋白的單一抑制機制不△同,AcrVA4能夠在反應過程中的多個步驟影響Cas12a發揮活性。這些發現拓展了我們對於Acr蛋白作用機制的了解,為設計可調控的基因編№輯系統提供了重要理論基礎(轉自【病毒學界)。

                 

                參考文獻:

                1.Watters, K.E., et al., Systematic discovery of natural CRISPR-Cas12a inhibitors. Science, 2018. 362(6411): p. 236-239.

                2.Marino, N.D., et al., Discovery of widespread type I and type V CRISPR-Cas inhibitors. Science, 2018. 362(6411): p. 240-242.

                3.Dong, L.Y., et al., An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation. Nature Structural & Molecular Biology, 2019. 26(4): p. 308-314.

                4.Knott, G.J., et al., Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a. Nature Structural & Molecular Biology, 2019. 26(4): p. 315-321.

                2019年11月12日 09:13
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